近日，南方科技大学朱健康院士团队在 Cell Research在线发表题为“Structure and genome editing activity of the novel CRISPR-Cas12o1 effector”该研究成功开发了一类能在人类细胞以及单双子叶植物中进行高效基因组编辑的新型紧凑型CRISPR-Cas12o系统。

CRISPR-Cas基因编辑技术在基础研究、动植物育种、核酸检测和基因治疗等多个领域展现出广泛的应用潜力。Cas蛋白作为该系统的核心组件，除了广为人知的II型Cas9蛋白外，V型Cas12家族（如Cas12a至Cas12n）也逐渐被发掘。尽管多种Cas12蛋白已被鉴定，但小型的Cas12蛋白通常编辑效率有限，需要长的tracrRNA来引导切割。

为了进一步扩充基因编辑的工具箱，通过搜索微生物基因组和宏基因组（IMG/M）数据库，鉴定到了一个新的Cas12o家族（蛋白大小在820-1135个氨基酸之间），Cas12o与Cas12b的亲缘关系比较近，但不需要长链的tracrRNA即可进行编辑。

研究人员从Cas12o家族中选取了6个不同的成员测试了其PAM序列，发现其能识别ATG和TTN的PAM类型，在动物细胞多靶点测试中，发现Cas12o1（识别ATG的PAM）有2-4%的编辑效率，后续选择Cas12o1进行进一步的研究。Cas12o1含有36bp的DR序列，最优的spacer长度为20bp, 体外切割实验显示，其切割温度范围为25℃-52℃，切割非靶向序列的速度（NTS）要快于靶向链的速度（TS）。Cas12o1切割靶向序列后产生5个碱基的粘性末端，体内靶点的编辑类型主要是大片段的缺失，此外，Cas12o1也具有反式切割活性，能切割单链DNA/RNA靶标分子，可以开发成核酸检测的工具。

图1 Cas12o1的生化特征测试

研究人员利用冷冻电镜解析了Cas12o1与靶dsDNA结合的三元复合物的冷冻电镜结构，Cas12o1与Cas12b的结构相似，都是由核酸识别Helical-I and Helical-II结构域及切割相关OBD, RuvC和Nuc结构域组成。通过对结构进行分析，Cas12o1的crRNA由两段相连的茎环结构组成并折叠成一种独特的高级结构，这一结构主要被Helical-II结构域特异性识别。另外，crRNA和与其配对的靶标链DNA形成的双链定位于由Rec和Nuc结构域组成的带有正电荷的通道中。Cas12o1独特的’ATG’ PAM序列通过序列特异性和非特异性两种方式被识别，对参与识别的关键残基进行突变都会导致Cas12o1系统的基因编辑能力显著下降。

图2 Cas12o1的三维结构和关键氨基酸残基

根据Cas12o1的结构信息，研究人员对Cas12o1进行蛋白改造，首先选取了核算识别区域带负电的氨基酸（D/E）突变为带正电的氨基酸（R）发现E100R活性对比野生型提升了5倍，随后进行饱和突变，发现E100K（Cas12o v1）的编辑效率对比野生型提升到了8倍左右。随后，研究人员解析了E100K的三维结构，发现E100K突变后增加了与PAM序列ATG中G的结合能力（由5 Å到3.5 Å），提升了双链的解旋能力从而提升了基因编辑效率。

在Cas12o v1的基础上，研究人员通过对与核酸互作的氨基酸，Nuc结构域的氨基酸以及同源氨基酸进行替换，利用荧光报告系统进行筛选，最终获得了Cas12o1 v2（E100K/S400R/L763R/S45T）。在293T细胞30个内源靶点的测试中，Cas12o1 v2的编辑效率与Cas9效果相当，并且能够识别更广泛的PAM序列, 我们将Cas12o1 v2 命名为Cas-SF02。Cas12o1 v2在植物（水稻稳定转化和大豆毛状根系统）中的基因编辑效率对比Cas12o1 WT和v1显著提高，最高编辑效率可达80%。综合而言，该研究鉴定Cas12o新家族，解析了Cas12o1识别切割靶向序列的机制，通过蛋白定向进化技术极大提升了Cas12o1的基因编辑活性，为动植物基因编辑研究提供了新的工具。

图3 Cas12o1的定向改造和在动植物细胞中活性测试

南方科技大学前沿生物技术研究院博士后段志强，张溪博士，医学院博后张峻涛和前沿生物技术研究院博士生吉兴坤为本论文的共同第一作者，山东舜丰生物科技有限公司刘锐恒，陈莹，李珊珊等参与本研究工作并提供重要的实验支持。南方科技大学医学院贾宁副教授和前沿生物技术研究院院长、舜丰生物首席专家顾问朱健康院士为本论文的通讯作者。本项工作得到国家自然科学基金，深圳自然科学基金，广东省创新委员会和山东舜丰生物科技有限公司的支持。